Малая РНК Pseudomonas aeruginosa регулирует хроническую и острую инфекцию.

Nature, том 618, страницы 358–364 (2023 г.) Процитировать эту статью

16 тысяч доступов

219 Альтметрика

Подробности о метриках

Способность переключаться между разными образами жизни позволяет бактериальным патогенам процветать в различных экологических нишах1,2. Однако молекулярное понимание изменений их образа жизни внутри человека-хозяина отсутствует. Здесь, непосредственно исследуя экспрессию бактериальных генов в образцах человеческого происхождения, мы обнаружили ген, который управляет переходом от хронической инфекции к острой у условно-патогенного микроорганизма Pseudomonas aeruginosa. Уровень экспрессии этого гена, названного здесь sicX, является самым высоким из генов P. aeruginosa, экспрессируемых при хронической раневой инфекции человека и муковисцидозе, но он экспрессируется на чрезвычайно низких уровнях во время стандартного лабораторного выращивания. Мы показываем, что sicX кодирует небольшую РНК, которая сильно индуцируется в условиях низкого содержания кислорода и посттранскрипционно регулирует анаэробный биосинтез убихинона. Удаление sicX заставляет P. aeruginosa переключаться с хронического образа жизни на острый в многочисленных моделях инфекции у млекопитающих. Примечательно, что sicX также является биомаркером этого перехода из хронического состояния в острое, поскольку его регуляция в наибольшей степени подавляется, когда хроническая инфекция распространяется и вызывает острую септицемию. Эта работа решает многолетний вопрос о молекулярной основе, лежащей в основе перехода от хронического состояния к острому у P. aeruginosa, и предполагает, что кислород является основным экологическим фактором острой летальности.

Многие патогенные бактерии могут колонизировать своих хозяев и хронически персистировать. В некоторых случаях бактерии распространяются из очагов первичной инфекции в другие части тела, что приводит к острым системным заболеваниям. Центральный вопрос биологии — понять молекулярные механизмы и сигналы окружающей среды, управляющие этим изменением образа жизни. Оппортунистический человеческий патоген P. aeruginosa может вызывать как острые, так и хронические инфекции, которые, как известно, трудно поддаются лечению. P. aeruginosa существует в виде одиночных клеток (планктонный образ жизни) или агрегатов, заключенных в матрикс (образ жизни биопленок), которые, как считается, способствуют острым и хроническим инфекциям соответственно. Поэтому лабораторные исследования традиционно были сосредоточены на изучении биопленко-планктонного перехода P. aeruginosa in vitro с целью понять изменения образа жизни этого патогена у людей. Десятилетия работы показали, как глобальные регуляторные системы, такие как вторичный мессенджер циклического ди-GMP3,4,5 и система Gac-Rsm2,6,7,8,9,10,11,12, контролируют переход биопленка-планктон P aeruginosa in vitro, что дает критически важную информацию об истории жизни этой бактерии. Однако до сих пор остается неясным, как P. aeruginosa реагирует на сигналы окружающей среды и, соответственно, меняет образ жизни инфекции у млекопитающих-хозяев. В этом исследовании мы восполнили этот пробел в знаниях, используя транскриптомы P. aeruginosa, полученные из образцов человеческого происхождения, для обнаружения и механистической характеристики новой малой РНК, называемой мРНК-индуктором хронической инфекции X (SicX), которая управляет хронической инфекцией P. aeruginosa. или срочное решение во время инфекции млекопитающих.

Ранее мы получили транскриптомы P. aeruginosa высокого разрешения из образцов инфекции человека, включая образцы мокроты пациентов с муковисцидозом и образцы хирургической обработки пациентов с хроническими ранами13,14. Используя методы машинного обучения, мы идентифицировали 30 генов P. aeruginosa, уровни экспрессии которых в совокупности отличают рост P. aeruginosa у людей от лабораторных13. Более половины этих генов не охарактеризованы, что подчеркивает существенный пробел в знаниях о биологии заражения человека P. aeruginosa. В эти гены с неизвестной функцией включен PA1414 (локус-метка в штамме P. aeruginosa PAO1), уровень экспрессии которого у человека был в 222 раза выше, чем в лаборатории, и его уровень экспрессии является самым высоким из экспрессируемых генов P. aeruginosa. при заражении человека (рис. 1а). Затем мы сравнили относительную численность (транскриптов на миллион (TPM)) транскриптов PA1414 с транскриптами других белков, кодирующих (5893 гена) и некодирующих (199 sRNA)15 (рис. 1b). В среднем транскрипты PA1414 составляли 13,85% TPM в транскриптомах P. aeruginosa, полученных из образцов хронической инфекции человека, и, что примечательно, в некоторых случаях они составляли почти 50% от общего TPM. Однако уровень экспрессии PA1414 был крайне низким у P. aeruginosa, выращенного в стандартных условиях in vitro. PA1414 представляет собой небольшой ген (длиной 234 пары оснований) с неизвестной функцией. Исследование 261 полного генома P. aeruginosa выявило 258 ортологов PA1414 (рис. 1c и расширенные данные, рис. 1), а гомологи не были идентифицированы у других видов Pseudomonas или других организмов. Последовательности ДНК ортологов PA1414, включая их вышерасположенные промоторные области, высококонсервативны (рис. 1d), что позволяет предположить, что PA1414 имеет консервативную функцию и регуляция его экспрессии универсальна для всех изолятов P. aeruginosa.

2, |log2[fold change]| > 1) for identifying differentially expressed genes. The upregulated (green) and downregulated (blue) genes in humans are colour-coded differently. Grey bubbles indicate genes that are not differentially expressed. b, Relative transcript abundance (TPM) of PA1414 compared to those of all other protein-coding sequences (CDSs) and non-coding sRNAs in 54 transcriptomes examined in a, sorted from the highest to the lowest PA1414 TPM. Average PA1414 TPM is indicated with dashed lines. c, PA1414 orthologues are found only in P. aeruginosa. Green and black bars indicate the presence and absence of orthologues, respectively. d, DNA sequence conservation of PA1414 and its neighbouring genes among 258 PA1414-containing P. aeruginosa isolates. Below, the percentage of orthologues identical to the PA1414 allele from PA14 at each nucleotide is shown./p> 103, PA1414 ranking < 102) for identifying transcriptomes with high PA1414 expression. b, β-galactosidase assay examining the induction of PA1414 under anaerobic and static conditions. PPA1414-lacZ, lacZ transcriptionally fused to PA1414 promoter; PPA1414*, PA1414 promoter containing mutations in the Anr-binding motif; MrT7, MAR2xT7 transposon. n ≥ 4 independent experiments. c, Northern blot analysis of PA1414 expression. Estimated size (nucleotides, nt) are indicated on the left. 5S rRNA served as a loading control. For gel source data, see Supplementary Fig. 1. d, Colony biofilm growth of ΔPA1414 and WT in different P. aeruginosa strain backgrounds. The presence and absence of oxygen are indicated. The CFU of ΔPA1414 was normalized against the CFU of the WT in each experiment (n = 4). A dashed line highlights the point where the CFU ratio = 1. e, Percentage of tetracycline-resistant (TetR) cells before and after daily passages under anaerobic conditions (n = 3). TetS, tetracycline sensitive; Δ, ΔPA1414. f, RNA-seq reads aligned to the PA1414 locus during standard in vitro growth and human infections. Blue shade indicates Rho-independent terminator in PA1414. g, Colony biofilm growth of ΔsicX harbouring different sicX mutations under anaerobic conditions. n = 4 independent experiments. h, Comparative proteomic study identifies the targets of SicX under both static and anaerobic conditions. i, β-galactosidase assay evaluating the translational control of SicX on ubiUVT under anaerobic conditions (n ≥ 4). j, β-galactosidase assay evaluating the transcription of ubiUVT in the absence of SicX or Anr under static conditions (n ≥ 8). k, Quantification of anaerobic UQ9 synthesis in different strains (n = 4). l, A model of dual regulation of ubiUVT expression by Anr and SicX. Error bars represent standard deviation from the mean. Significant differences (compared to the WT) are indicated with asterisks (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; two-tailed Mann–Whitney test)./p>108 colony-forming units (CFUs) g−1; Fig. 3c). However, among mice carrying a high wound burden (>108 CFUs g−1), ΔsicX caused more systemic infection (12 out of 15) compared to WT (2 out of 11), indicating that dissemination did not solely depend on the wound burden (two-tailed Fisher’s exact test, P = 0.0043; Fig. 3c). Moreover, these observations are not due to differential fitness of WT and ΔsicX in spleens. This was demonstrated using an acute skin infection model in which systemic infection occurs shortly after subcutaneous injection into the mouse inner thigh. In this model, WT and ΔsicX exhibited similar colonization and growth in spleens (Extended Data Fig. 6). Taken together, our data indicate that SicX is a key player in P. aeruginosa chronic infection, the high expression of which promotes chronic localized infection./p>90% and query coverage values of >90% were retained for further analysis. Sequences of sicX and ubiUVT orthologues were aligned using MUSCLE43. To analyse the sequence conservation of sicX and ubiUVT orthologues, we first aligned sicX and ubiUVT orthologues using MUSCLE. Next, alignment ends were trimmed and gaps were removed, and percentages of orthologue sequences that are identical to sicX and ubiUVT queries were calculated at each nucleotide position in R. To create Extended Data Fig. 4b,c, the alignments were visualized in Jalview44 using the default nucleotide colour scheme./p>